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rdb05956ja

CMV tag vectors

Catalog num. Name of clone Description of resource
RDB02136 S-HA-pRc/CMV Expressing HA-tagged fusion protein, CMV promoter
RDB02139 D-HA-pRc/CMV Expressing a fusion protein tagged with duplicated HA, CMV promoter
RDB02137 S-T7-pRc/CMV Expressing T7-tagged fusion protein, CMV promoter
RDB02138 D-T7-pRc/CMV Expressing a fusion protein tagged with duplicated T7, CMV promoter
RDB02140 S-Myc-pRc/CMV Expressing Myc-tagged fusion protein, CMV promoter
RDB02141 D-Myc-pRc/CMV Expressing a fusion protein tagged with duplicated Myc epitopes, CMV promoter

これら6クローンは、竹本佳弘先生により開発され、DNA Cell Biol 1997 Jul;16(7):893-896に発表された哺乳動物細胞発現ベクターである。ヒトサイトメガロウイルス由来のプロモーター（CMV promoter）を搭載していて、NotIサイトに目的遺伝子のORFを挿入することにより、エピトープでtaggingされた目的遺伝子の発現プラスミドが得られる。エピトープにはHA、T7、Mycが選択可能であり、それぞれ1コピーおよび2コピーのタグが用意されている。これら6クローンのNotIサイトは共通の読み枠にあるので、NotIを利用したベクター乗り換えも可能である。（理研BRC・遺伝子材料開発室）
Sequence of MCS (pdf)

pRSV_S-FLAG

Catalog num. Name of clone Description of resource
RDB06083 pRSV_S-FLAG Expressing FLAG-tagged fusion protein, RSV promoter

哺乳動物細胞発現ベクターpRSV_S-FLAGはpRc/RSVより改変したベクターであり、RDB 5956 pCMV_S-FLAGのバリアントである。レトロウイルス由来のプロモーター（RSV promoter）を搭載していて、NotIサイトに目的遺伝子のORFを挿入することにより、FLAGエピトープ (Met-DYKDDDDK)でtaggingされた目的遺伝子の発現プラスミドが得られる。制限酵素により切出した断片によるクローニングの他、NotI サイトをklenow enzyme で平滑化し、そこに第１コドンのATGから始まるPCR断片を組込むことも可能である。ただし、ATGGとなる配列で始まるPCR断片を組込むとGCGGCCATGGとなり、NcoIサイト(CCATGG)ができるので注意が必要である。このような場合は、第２コドンから始まるPCR断片を作製されることをお勧めする。タグの配列の翻訳開始点にはKozakのconsensus 配列 (CACCATG)がある。またここにあるNcoIサイト(CCATGG)のATGと同じ読み枠でタグの配列が続くので、NcoIサイトを利用して切出すことで、多くの大腸菌発現ベクターに同じ読み枠で載せ換えることも可能である。この配列のすぐ上流にはEcoRI サイトがあるので、タグのついた配列を切出し、アデノウイルスベクター (pAxCAwtit2など)に載せ換えることも可能である。pRSV_tagベクターシリーズは、ネオマイシン耐性遺伝子を搭載したベクターであり、薬剤による導入細胞の選択が可能である。（理研BRC・遺伝子材料開発室）

pCMV_s-FLAGc

Catalog num. Name of clone Description of resource
RDB07396 pCMV_s-FLAGc Destination vector to generate eukaryotic expression vector, with FLAG-tag

哺乳動物細胞発現ベクターpCMV_s-FLAGcはpCMV_S-FLAG (RDB 5956)より改変したCMV promoterによる発現ベクターである。Gateway(R)テクノロジーにより、Gateway(R)エントリークローンにクローニングされている遺伝子断片を容易にこのpCMV_s-FLAGcに載せ替えることができる。ネオマイシン耐性遺伝子を搭載したベクターであり、薬剤による導入細胞の選択が可能である。（理研BRC・遺伝子材料開発室）

pCMV_S-FLAG

Catalog num. Name of clone Description of resource
RDB05956 pCMV_S-FLAG Expressing FLAG-tagged fusion protein, CMV promoter
RDB06324 pCM1_s-FLAG Expressing FLAG-tagged fusion protein, mutated CMV promoter
RDB06325 pCM2_s-FLAG Expressing FLAG-tagged fusion protein, mutated CMV promoter
RDB06326 pCM3_s-FLAG Expressing FLAG-tagged fusion protein, mutated CMV promoter
RDB06072 pCMFlag_lacZ Expression vector of lacZ, with FLAG-tag, control vector
RDB06071 pCMFlag_EGFP Expression vector of GFP, with FLAG-tag, control vector

哺乳動物細胞発現ベクターpCMV_S-FLAGはpRc/CMVより改変したベクターである。ヒトサイトメガロウイルス由来のプロモーター（CMV promoter）を搭載していて、NotIサイトに目的遺伝子のORFを挿入することにより、FLAGエピトープ (Met-DYKDDDDK)でtaggingされた目的遺伝子の発現プラスミドが得られる。制限酵素により切出した断片によるクローニングの他、NotI サイトをklenow enzyme で平滑化し、そこに第１コドンのATGから始まるPCR断片を組込むことも可能である。ただし、ATGGとなる配列で始まるPCR断片を組込むとGCGGCCATGGとなり、NcoIサイト(CCATGG)ができるので注意が必要である。このような場合は、第２コドンから始まるPCR断片を作製されることをお勧めする。タグの配列の翻訳開始点にはKozakのconsensus 配列 (CACCATG)がある。またここにあるNcoIサイト(CCATGG)のATGと同じ読み枠でタグの配列が続くので、NcoIサイトを利用して切出すことで、多くの大腸菌発現ベクターに同じ読み枠で載せ換えることも可能である。この配列のすぐ上流にはEcoRI サイトがあるので、タグのついた配列を切出し、アデノウイルスベクター (pAxCAwtit2など)に載せ換えることも可能である。pCMV_tagベクターシリーズは、ネオマイシン耐性遺伝子を搭載したベクターであり、薬剤による導入細胞の選択が可能である。
pCM1_s-FLAG、pCM2_s-FLAGならびにpCM3_s-FLAGは、pCMV_S-FLAGのCMVプロモーター上にあるTGACTCAに塩基置換を施した変異プロモーターを持つ。
RDB 5956 pCMV_S-FLAG ATA GCG GTTTGA CTC ACG GGG
RDB 6324 pCM1_s-FLAG ATA GCG GTT TGC CTCGCG GGG
RDB 6325 pCM2_s-FLAG ATA GCG GTT AGA CTC CCG GGG
RDB 6326 pCM3_s-FLAG ATA GCG G–T TGC CTC GCG GGG
（理研BRC・遺伝子材料開発室）

map of RDB05956

 

ベクターの使用例

GFPならびにlacZ発現ベクターの構築

  1. pCMV_S-FLAG (RDB 5956)をNotI 消化後klenow enzyme により平滑化し、アガロースゲル電気泳動を行い、約5.5 kbpのDNA断片を回収した。
  2. pEGFP-C1 (Clontech)ならびにpcDNA4/HisMax/lacZ (Invitrogen)のGFPならびにlacZのORFをPCRにより増幅した。
  3. このPCR産物を消化済みpCMV_S-FLAGにDNA Ligation kit ver.1 (Takara)を用いてライゲ－ションした。
  4. 大腸菌コンピテントセルDH5 alpha に導入し、アンピシリンを含むLBプレートに播き、形質転換体を得た。
  5. 得られたコロニーをLB Amp液体培地にて培養し、培養細胞導入用のプラスミドを調製した。

Primer配列
GFP primer
GFP_F 5′-ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG -3′
GFP_R 5′-TTATCTAGATCCGGTGGATCC -3′
lacZ primer
lacZ_F 5′-GATCCCGTCGTTTTACAACGT -3′
lacZ_R 5′-TTATTTTTGACACCAGACCAA -3′

 

GFP、beta-galactosidaseならびにFLAGタグの検出

本ベクターを用いた遺伝子導入、顕微鏡観察ならびにウエスタンブロッティングによるGFP、beta-galactosidaseならびにFLAGタグの検出は、ラボマニュアル発現ベクターの使用をご覧ください。

提供形態ならびに提供申込方法

  • 個別のクローンをＤＮＡ溶液 (TE buffer)でお送りします。

生物遺伝資源提供依頼書類の入手と記入

次の書式に記入してください:

  • 書式A
    書式A （遺伝子材料提供依頼書） [Word] [依頼書の記入例]1部
  • 書式C
    • 提供制限欄には、クローン毎にウェブカタログをご参照いただき、記入をお願いいたします

    書式C (生物遺伝資源提供同意書, MTA) 非営利学術目的用 [Word]

    書式C (生物遺伝資源提供同意書, MTA) 営利目的用 [Word]    		2部
  • その他の書式
      提供承諾書(書式D)(クローンにより、必要な場合があります) 1部
  • 書類の送付とお問い合わせ
    書類手続きにつきましては、PDFでの取り交わしを推奨しています。

    • PDFでの取り交わしの可否については、事前にご所属の知財担当部署にご相談ください。
      カラースキャンしたPDFファイルをemailにてお送りください。

    • 公印押印済みMTAの原本（書面）の返送をご希望の場合は、原本（書面）2部を当室へお送りください。なお、書類の返送に係る送料をご負担いただきます。

    • 書類をPDFで取り交わす場合でも、締結済み書類の返送が別送となりそれに係る送料をご負担いただく場合がございます。
      例）　書類返送が別送となる場合の例
      1.　冷凍品（ゲノムDNA）や組換え体など、リソースを宅配便で配送する場合
      2.　リソースとは別の部署への書類の返送をご希望の場合
      3.　リソース発送前に書類返送をご希望の場合

    • 書類の送付先、問い合わせ先
      〒305-0074　 茨城県つくば市高野台3-1-1
      　 理化学研究所バイオリソース研究センター (BRC)
      　 遺伝子材料開発室
      　 E-mail: dnabank.brc@riken.jp
      　 TEL: 029-836-3612 (平日の9:00～12:00 / 13:00～17:00)

    • 提供申込の前に、「申込書類の記入と送付」「ご利用にあたって」「遺伝子材料の品質管理」をご覧ください。

    • 書式の詳細は「申込みに必要な書式」をご覧ください。
  • 提供手数料：（1本あたり)
    非営利学術目的利用9,460円
    営利目的利用18,920円
    • 2023年4月1以降の提供手数料です。
    • 「非営利学術目的利用」および「営利目的利用」の区分ならびに「提供手数料」は、「提供手数料と支払方法」をご参照ください。
    • 別途、リソースの送料並びに箱代及びドライアイス代等が加算されます。
    • 請求書は提供依頼書に記載された「担当者」に送付いたします。特別な様式の請求書・納品書・領収書を必要とされる場合は、予めその旨をご相談いただくようお願いいたします。請求書は遺伝子材料とは別に送付いたします。
    • 提供手数料は指定の銀行口座にお振込みください。振込み手数料につきましては、依頼者負担にてお願い致します。

    •  
    (GRP0049, 2015.06.04)
    2018.03.04



 

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