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News
新センター長就任のお知らせ (2019/4/1 T.M.)
本庶佑先生ノーベル賞受賞おめでとうございます！ (2018/10/3 T.M.)
2018年ノーベル医学・生理学賞にかかわるクローンを取り揃えております (2018/10/3 T.M.)
活発なご利用をお待ちいたしております。
Focused Resource
 ゲノム編集が起こった細胞を効率良く選択するためのプラスミド pCAG-NexxoR (2019/6/21 H.S.)
- 国立精神・神経医療研究センター 照光実加先生、橋戸和夫先生らの研究グループにより開発された、ゲノム編集が設計通りに起きた細胞を薬剤耐性により効率的に濃縮できるプラスミド pCAG-NexxoR が到着しました。
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- まずターゲット配列を含むゲノム断片を挿入したpCAG-NexxoR をモニタリング用プラスミドとして作製します。次に、ゲノム編集に必要な酵素およびガイドRNAをモニタリング用プラスミドと共に細胞に導入します。その後G418を加えた培地で耐性細胞を選択することにより、モニタリング用プラスミド上でゲノム編集が起きた細胞のみが生育し高効率でゲノム編集が起きた細胞を得ることができます。
照光先生らによるC2C12培養細胞を用いたパイロット実験では、約98%の効率で変異体が得られ、変異体中の約２％がホモ変異体でした。（図１）
- 寄託されたリソース
pCAG-NexxoR (cat# RDB16803)
pCAG-EGxxFP (RDB13532)のEGFPをネオマイシン耐性遺伝子に置き換え改変したプラスミドです。
- 実験結果の一例
ゲノム編集用プラスミドpX330-ガイドRNA（pX330にガイドRNA配列を挿入)、pCAG-EGxxFP-target (pCAG-EGxxFPにtarget配列を挿入)をC2C12細胞にCotransfectionし、24時間後からG418添加培地で培養しました。このとき、pCAG-NexxoR-target（pCAG-NexxoRにtarget配列を挿入）、あるいはpCAG-NeoR (G418耐性遺伝子発現ベクター) もTransfectionしました。
この結果から、薬剤耐性遺伝子の共発現だけでは選別できないことが示されNexxoRの有用性が示されました。（実験結果は、国立精神・神経医療研究センターの照光先生に提供していただきました。）
図１．左： G418添加48時間でゲノム編集を生じた細胞（GFP陽性）が選別され、GFP陰性細胞はほぼ見られませんでした。
中： G418添加無ではGFP陰性細胞が多く見られました。
右： pCAG-NeoRのCotransfectionではゲノム編集を生じた細胞（GFP陽性）が選別されずGFP陰性細胞が多く見られました。
細胞内の異種オルガネラ間の相互作用部位を可視化できる蛍光タンパク質プローブ(2019/3/29 N.N.)
- 分断されたGFPは、至近距離で存在すると再構成され、再び蛍光を発光するという特徴を有しています。
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ショウジョウバエ培養細胞での組換えタンパク質発現用プラスミド(2019/2/22 T.Y.)
- ショウジョウバエS2細胞を使った組換えタンパク質発現系は広く利用されています。
これまでも筆者らが構築したpMT-PURO (cat# RDB08532) が組換えタンパク質の発現に用いられていましたが、本誌においては安定発現株の作製をさらに効果的に行うために以下のプラスミドを構築しました。
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- 1. pMT-PURO2 (cat# RDB12152): ピューロマイシン耐性マーカーのpuromycin N-acetyl-transferase (pac)を安定して発現させるためにpac遺伝子上流にkozak配列を導入したプラスミドです。
- 2. pMT-PURO2G (cat# RDB09004): ピューロマイシン耐性マーカーpacに融合したEGFPを観察することで形質転換効率や遺伝子導入効率の評価ができます。
- 3. pMT-PURO2R (cat# RDB09005): ピューロマイシン耐性マーカーpacに融合したDsRED2を観察することで形質転換効率や遺伝子導入効率の評価ができます。
- 目的遺伝子はmetallothionein プロモーター下流のMCSに挿入します。作製した安定発現株はCuSO4を添加することで目的遺伝子の発現を誘導することができます。
- 論文
Nagahashi, K. et al. Fusion of fluorescent protein to puromycin N-acetyltransferase is useful in Drosophila Schneider S2 cells expressing heterologous proteins. Cytotechnology. 65 (2): 173-178, 2013. PMID : 22706964.
- 寄託されたリソース
pMT-PURO (cat# RDB08532)
pMT-PURO2 (cat# RDB12152)
pMT-PURO2G (cat# RDB09004)
pMT-PURO2R (cat# RDB09005)
オプトジェネティクス（光遺伝学）手法用の発現ベクター(2019/1/11 N.N.)
- 東北大学の石塚 徹先生が開発したチャネルロドプシン発現ベクターが提供可能です。[more…]
Cre/loxPシステムによりmCherry発現を誘導するベクター (2018/12/07 S.H.)
- 大阪大学畠中由美子先生らの研究グループより、Cre/loxPシステムにより誘導可能なmCherry発現ベクターが到着しました。[more…]
- 発表論文では、pCALNL5:mCherryを低濃度のCre組換え酵素発現ベクターと共にマウスの発生E12.5齢のVZ領域へトランスフェクションすることにより、神経前駆細胞をクローナルに標識しました。神経前駆細胞と軸索様突起はmCherryで標識されており、経時的な観察により、軸索様突起の数や長さにより細胞を分類しその動態を明らかにしました。
- 論文
Hatanaka, Y. and Yamauchi, K. Excitatory Cortical Neurons with Multipolar Shape Establish Neuronal Polarity by Forming a Tangentially Oriented Axon in the Intermediate Zone. Cerebral Cortex J., 23: 105, 2013. PMID 22267309.
- 寄託されたリソース
pCALNL5:mCherry (cat# RDB16747)
- Cre組換え酵素発現ベクター
理研DNA BANKでは各種Cre組換え酵素発現ベクター[link]を提供しております。
Dnacondaのおすすめ (過去の掲載記事)
Resource Information
 IL1B遺伝子発現制御における転写コアクチベーターTAZの機能 (2019/05/13 T.M.)
- 悪性中皮腫の表現型にYAP遺伝子が関与することがこれまで示されてきました。一方、YAPのパラログであるTAZの悪性中皮腫への関与は十分に明らかにされていませんでした。[more…]
- 本論文では、活性型TAZ (S89A)により、不死化中皮細胞が形質転換することが示され、マイクロアレイによるmRNA発現解析と遺伝子オントロジー解析の結果、TAZがサイトカイン遺伝子の発現制御に関わることが示されました。悪性表現型におけるTAZの機能は、活性型TAZの発現後のIL1A, IL1B, IL6ならびにIL24のmRNA発現および各遺伝子のノックダウンによる細胞増殖への影響により調べられ、IL1BがTAZの下流遺伝子であることが分かりました。
- TAZによるIL1B遺伝子発現の活性化の検定に、pKM2L-phIL1Bルシフェラーゼレポーターが使われました。
- 論文
Matsushita, A., Sato, T., Mukai, S., Fujishita, T., Mishiro-Sato, E., Okuda, M., Aoki, M., Hasegawa, Y., Sekido, Y.. TAZ activation by Hippo pathway dysregulation induces cytokine gene expression and promotes mesothelial cell transformation. Oncogene 38: 1966-1978 (2019). PMID 30401981.
- 使用されたリソース
pKM2L-phIL1B (cat# RDB05526)
HMGA1はPLAUとSERPINE1遺伝子の制御を通じてurokinase plasminogen activatorシステムに影響を与える (2019/04/12 T.M.)
- HMGA1は、がんのトランスフォーメーションの様々な側面の遺伝子制御に関わることが知られています。[more…]
- 筆者らは始めに、HMGA1の発現レベルに対応する分泌性タンパク質群を明らかにしました。これらのうち、最もよく解析されたがんの浸潤と拡散に関わる経路であるurokinase plasminogen activatorシステムに影響するPLAUとSERPINE1遺伝子の発現調節領域に対して正の調節機能があることを示しました。両遺伝子のプロモーター解析にpGL4-phPLAU (RDB07487) とpGL4-phSERPINE1(PAI-1) (RDB07461) が使われました。
- 論文
Resmini, G., Rizzo, S., Franchin, C., Zanin, R., Penzo, C., Pegoraro, S., Ciani, Y., Piazza, S., Arrigoni, G., Sgarra, R., Manfioletti, G. HMGA1 regulates the Plasminogen activation system in the secretome of breast cancer cells. Sci. Rep. 7 (1): 11768 (2017). PMID: 28924209.
- 使用されたリソース
pGL4-phPLAU (cat# RDB07487)
pGL4-phSERPINE1(PAI-1) (cat# RDB07461)
DNAミスマッチ修復の過程におけるATPの加水分解により、MutSはMutLのエンドヌクレアーゼ活性を亢進する (2019/03/15 N.N.)
- DNAミスマッチ修復はMutSによるミスマッチ塩基対の認識とMutL及び修復にかかわるタンパク質のリクルートによって行われます。[more…]
- MutLの非特異的DNA切断はATP結合により抑制されていますが、そのエンドヌクレアーゼ活性の活性化機構は不明でした。本研究において筆者らはMutLのエンドヌクレアーゼ活性のATP結合依存的な抑制がATPの加水分解によって解除されることを見出しました。
本研究では、当室から提供した MutSタンパク質発現クローンTEx18D08 (cat.# THR007280)
及び MutLタンパク質発現クローンTEx18C04 (cat.# THR007252) がATPase assayに使用されました。
- 論文
Shimada A, Kawasoe Y, Hata Y, Takahashi TS, Masui R, Kuramitsu S, Fukui K. MutS stimulates the endonuclease activity of MutL in an ATP-hydrolysis-dependent manner. FEBS J. 280(14):3467-3479, 2013. PMID : 23679952.
- 使用されたリソース
TEx18D08 (Thermus thermophilus MutS)
TEx18C04 (Thermus thermophilus MutL)
オートファジー活性を定量的に評価できるプローブ(2019/2/1 N.N.)
- オートファゴソームを可視化してオートファジーを観察するためにMAP1LC3 (LC3)と蛍光タンパク質を融合させたプローブが利用されています。一方で、オートファジーの進行に伴いプローブの蛍光が減衰するため、定量的な活性評価には不向きでした。
- 東京大学の水島昇先生らは、LC3とGFPを融合したGFP-LC3と、末端のグリシン (G)を欠くLC3とRFPを融合したRFP-LC3ΔGを同時に当モル量で発現するプローブを開発しました。[more…]
Akaluc 新規開発の赤色発光のルシフェラーゼ (2018/5/7 N.N.)
- ホタルの生物発光システムは、生命現象のイメージングに汎用されていますが、発光基質の組織透過性が低いという欠点がありました。理研脳神経科学研究センターの宮脇 敦史先生、岩野 智先生、電気通信大学大学の牧 昌次郎先生らのグループは、生きた動物個体深部を非侵襲的に観察できる人工生物発光システムAkaBLIを開発しました。[more…]
- AkaBLIシステムは、組織透過性の向上した人工基質AkaLumineとAkaLumineに合わせて開発した人工酵素Akalucで構成されています。AkaBLIの発光シグナルの強度は、従来と比べ100～1000倍です。
- 宮脇研究室より、人工酵素Akalucの発現ベクターが当遺伝子材料開発室に寄託され、提供可能となりました。皆様の活発なご利用をお待ちしております。
- 論文
Iwano, S. et al., Single-cell bioluminescence imaging of deep tissue in freely moving animals. Science 359 (6378): 935-939 (2018). PMID 29472486.
- プレス
「脳の深部を非侵襲的に観察できる人工生物発光システムAkaBLI」 (2018/2/23 理研)
- DNA resource
pcDNA3 Venus-Akaluc (cat# RDB15781)
ビオチン化タグ付加転写因子による安定したChIP-seq解析 (2018/2/16 K.N.)
- ChIP-seq解析は、網羅的な転写因子結合サイト解析の有効な手法の一つです。しかし、ChIP-seq解析の精度は抗体の品質に依存している問題点がありました。本論文では、ビオチン化タグを転写因子に付加して発現させ、アビジンビーズにより回収することで、ChIP-seq解析に適した抗体が得られない場合や多種類の転写因子を対象とする場合に、より簡便で安定したChIP-seq解析ができることを報告しています。[more…]
- 論文
Matsuda, K. et al., ChIP-seq analysis of genomic binding regions of five major transcription factors highlights a central role for ZIC2 in the mouse epiblast stem cell gene regulatory network. Development 144 (11): 1948-1958, 2017. [PMID 28455373]
- 寄託されたリソース
pCAGGS-BLRP-BirA (cat# RDB15774)
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