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Focused Resource
 効率的なPCRクローニングのための新規開発ベクター (2019/10/11 N.N.)
- PCRクローニングを効率的に行うことができる新規ベクターが、京都産業大学生命科学部の本橋 健 先生により開発され、本年4月に論文として発表されました(下記文献等をご参照下さい)。TAクローニング用、平滑末端クローニング用、並びに兼用の3種類があります。皆様の活発なご利用をお待ちしております。[more…]
組織を構成する細胞の形態や配列を調節する制御メカニズムの解明 (2019/9/6 N.N.)
- 組織を構成する細胞の形態と配向は細胞骨格の動態や細胞極性によって決定されています。細胞骨格の動態変化は、情報伝達物質のやりとりによって誘導されることが示唆されていますが、どの様にして細胞骨格の動態に反映されるか、その制御メカニズムは未解明でした。[more…]
- ゲノム編集するターゲット遺伝子が致死、あるいは検出が容易な表現型を示さないような場合、標的外の遺伝子変異を抑えることでスクリーニングと致死遺伝子同定に必要な労力を少しでも抑えることができます。ランダムにゲノムに挿入されるベクター数が多いとゲノムへの過剰なCas9酵素のアタックが起き、Off-targetの原因となると考えられています。
- 熊本大学大学院生命科学研究部の菊池 浩二先生らの研究グループは、Wnt5aのシグナル経路が細胞骨格を構成する微小管の動態制御に関わることに着目し、間をとりもつ分子を探索するため、siRNAライブラリーによる表現型スクリーニングを行い、Map7/7D1を同定しました。続いて、培養細胞やショウジョウバエ個体を用いたMap7/7D1のノックダウン実験などを経て、Map7/7D1がWnt5aシグナル経路における伝達物質の一つであるDvlと結合すること、Map7/7D1がDvlの局在を制御することを見出し、Wnt5aシグナル経路と微小管の動態変化を結びつける制御メカニズムを明らかにしました。
- 本研究には当室より提供したMAP7をコードするクローン(IRAK049L15)が用いられており、蛍光ライブイメージングのために作製したpEGFP-N3-hMap7によりMap7/7D1の細胞内局在を解析しています。pEGFP-N3-hMap7の他、計3種類のクローンは、菊池先生のご厚意により当室に寄託していただきました。皆様の積極的なご利用をお待ちしております
- 論文
Kikuchi, K. et al. Map7/7D1 and Dvl form a feedback loop that facilitates microtubule remodeling and Wnt5a signaling. EMBO Rep. 19 (7): e45471, 2018. PMID: 29880710.
- プレス
組織の形成に関わる、細胞の「かたち」や「ならび」を調節する新しい仕組みの解明 (熊本大学2018/6/7)
- 寄託されたリソース、提供したリソース
pEGFP-N3-hMap7 (cat# RDB16943)
pcDNA3.1-V5His6-hMap7 (cat# RDB16944)
pEGFP-N3-mMap7D1 (cat# RDB16945)
IRAK049L15 (cat# HGX019879)
高効率ゲノム編集用ベクター pGedit (2019/7/26 H.S.)
- 産業技術総合研究所 長崎 晃先生らの研究グループにより開発された、高効率ゲノム編集用ベクター pGedit が到着しました。[more…]
- ゲノム編集するターゲット遺伝子が致死、あるいは検出が容易な表現型を示さないような場合、標的外の遺伝子変異を抑えることでスクリーニングと致死遺伝子同定に必要な労力を少しでも抑えることができます。ランダムにゲノムに挿入されるベクター数が多いとゲノムへの過剰なCas9酵素のアタックが起き、Off-targetの原因となると考えられています。
- 長崎先生らが開発したpGedit (cat# RDB16763)はblasticidin S 耐性遺伝子 (Bsr) を持つCas9の発現ベクターです。より短時間で細胞を選択できるblasticidin S を使い、blasticidin Sの培地添加を24～48時間のみに限定することでベクターのゲノムへのインテグレーションを抑え、さらにEGFPをBsrと融合して発現することにより、ベクターの残存をモニターできるような工夫をしました。また、sgRNAスカフォールド内にあるRNA polymerase III terminal signal （TTTT）を取り除くことでsgRNA量を増加させ、ゲノム編集効率の増加を期待しています。
- このプラスミドの有用性をみるため、ヒト骨肉腫上皮細胞U2OSを用いて2種類のヒト細胞質アクチン遺伝子、ACTBとACTG1に対するターゲット配列をpGeditに挿入し、この２つの遺伝子ノックアウト細胞株を取得する実験を行いました。その結果、それそれの遺伝子について約20の候補細胞から少なくとも5個のノックアウト細胞株を得ることに成功しました。
- 論文
Nagasaki, A. et al. A genome editing vector that enable easy selection and identification of knockout cells. Plasmid, 98: 37-44, 2018. PMID : 30196057.
- 寄託されたリソース
pGedit (cat# RDB16763)
ゲノム編集が起こった細胞を効率良く選択するためのプラスミド pCAG-NexxoR (2019/6/21 H.S.)
- 国立精神・神経医療研究センター 照光実加先生、橋戸和夫先生らの研究グループにより開発された、ゲノム編集が設計通りに起きた細胞を薬剤耐性により効率的に濃縮できるプラスミド pCAG-NexxoR が到着しました。
[more…]
- まずターゲット配列を含むゲノム断片を挿入したpCAG-NexxoR をモニタリング用プラスミドとして作製します。次に、ゲノム編集に必要な酵素およびガイドRNAをモニタリング用プラスミドと共に細胞に導入します。その後G418を加えた培地で耐性細胞を選択することにより、モニタリング用プラスミド上でゲノム編集が起きた細胞のみが生育し高効率でゲノム編集が起きた細胞を得ることができます。
照光先生らによるC2C12培養細胞を用いたパイロット実験では、約98%の効率で変異体が得られ、変異体中の約２％がホモ変異体でした。（図１）
- 寄託されたリソース
pCAG-NexxoR (cat# RDB16803)
pCAG-EGxxFP (RDB13532)のEGFPをネオマイシン耐性遺伝子に置き換え改変したプラスミドです。
- 実験結果の一例
ゲノム編集用プラスミドpX330-ガイドRNA（pX330にガイドRNA配列を挿入)、pCAG-EGxxFP-target (pCAG-EGxxFPにtarget配列を挿入)をC2C12細胞にCotransfectionし、24時間後からG418添加培地で培養しました。このとき、pCAG-NexxoR-target（pCAG-NexxoRにtarget配列を挿入）、あるいはpCAG-NeoR (G418耐性遺伝子発現ベクター) もTransfectionしました。
この結果から、薬剤耐性遺伝子の共発現だけでは選別できないことが示されNexxoRの有用性が示されました。（実験結果は、国立精神・神経医療研究センターの照光先生に提供していただきました。）
図１．左： G418添加48時間でゲノム編集を生じた細胞（GFP陽性）が選別され、GFP陰性細胞はほぼ見られませんでした。
中： G418添加無ではGFP陰性細胞が多く見られました。
右： pCAG-NeoRのCotransfectionではゲノム編集を生じた細胞（GFP陽性）が選別されずGFP陰性細胞が多く見られました。
細胞内の異種オルガネラ間の相互作用部位を可視化できる蛍光タンパク質プローブ(2019/3/29 N.N.)
- 分断されたGFPは、至近距離で存在すると再構成され、再び蛍光を発光するという特徴を有しています。
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Dnacondaのおすすめ (過去の掲載記事)
Resource Information
 Atg2タンパク質は、オートファゴソーム膜の形成に必要な脂質分子の輸送に直接関与する。(2019/12/16 N.K.)
- オートファジーは、細胞内で不要タンパク質を分解・再利用するメカニズムの1つです。[more…]
- 不要タンパク質は、まずリン脂質膜構造のオートファゴソーム内に隔離されます。オートファゴソーム生合成には数種のAtgタンパク質群が関わっています。本研究において、筆者らは、Atg2タンパク質が、ERとオートファゴソームをつなぐテザリング活性を持ち、かつER膜からオートファゴソーム膜へのリン脂質分子の輸送に直接的にかかわることを、Ｘ線結晶構造解析、およびFRETを応用して開発した新規のリピドトランスファーアッセイ法を用いて明らかにしました。本研究には、出芽酵母と分裂酵母由来のAtg2タンパク質が用いられており、分裂酵母Atg2の発現ベクターを構築する際に当室が提供したSpFFH31A11 (SPW052411)が用いられました。
- 論文
Osawa, T. et al. Atg2 mediates direct lipid transfer between membranes for autophagosome formation. PMID 30911189.
- 使用されたリソース
SpFFH31A11 (SPW052411)
IL1B遺伝子発現制御における転写コアクチベーターTAZの機能 (2019/05/13 T.M.)
- 悪性中皮腫の表現型にYAP遺伝子が関与することがこれまで示されてきました。一方、YAPのパラログであるTAZの悪性中皮腫への関与は十分に明らかにされていませんでした。[more…]
- 本論文では、活性型TAZ (S89A)により、不死化中皮細胞が形質転換することが示され、マイクロアレイによるmRNA発現解析と遺伝子オントロジー解析の結果、TAZがサイトカイン遺伝子の発現制御に関わることが示されました。悪性表現型におけるTAZの機能は、活性型TAZの発現後のIL1A, IL1B, IL6ならびにIL24のmRNA発現および各遺伝子のノックダウンによる細胞増殖への影響により調べられ、IL1BがTAZの下流遺伝子であることが分かりました。
- TAZによるIL1B遺伝子発現の活性化の検定に、pKM2L-phIL1Bルシフェラーゼレポーターが使われました。
- 論文
Matsushita, A., Sato, T., Mukai, S., Fujishita, T., Mishiro-Sato, E., Okuda, M., Aoki, M., Hasegawa, Y., Sekido, Y.. TAZ activation by Hippo pathway dysregulation induces cytokine gene expression and promotes mesothelial cell transformation. Oncogene 38: 1966-1978 (2019). PMID 30401981.
- 使用されたリソース
pKM2L-phIL1B (cat# RDB05526)
HMGA1はPLAUとSERPINE1遺伝子の制御を通じてurokinase plasminogen activatorシステムに影響を与える (2019/04/12 T.M.)
- HMGA1は、がんのトランスフォーメーションの様々な側面の遺伝子制御に関わることが知られています。[more…]
- 筆者らは始めに、HMGA1の発現レベルに対応する分泌性タンパク質群を明らかにしました。これらのうち、最もよく解析されたがんの浸潤と拡散に関わる経路であるurokinase plasminogen activatorシステムに影響するPLAUとSERPINE1遺伝子の発現調節領域に対して正の調節機能があることを示しました。両遺伝子のプロモーター解析にpGL4-phPLAU (RDB07487) とpGL4-phSERPINE1(PAI-1) (RDB07461) が使われました。
- 論文
Resmini, G., Rizzo, S., Franchin, C., Zanin, R., Penzo, C., Pegoraro, S., Ciani, Y., Piazza, S., Arrigoni, G., Sgarra, R., Manfioletti, G. HMGA1 regulates the Plasminogen activation system in the secretome of breast cancer cells. Sci. Rep. 7 (1): 11768 (2017). PMID: 28924209.
- 使用されたリソース
pGL4-phPLAU (cat# RDB07487)
pGL4-phSERPINE1(PAI-1) (cat# RDB07461)
DNAミスマッチ修復の過程におけるATPの加水分解により、MutSはMutLのエンドヌクレアーゼ活性を亢進する (2019/03/15 N.N.)
- DNAミスマッチ修復はMutSによるミスマッチ塩基対の認識とMutL及び修復にかかわるタンパク質のリクルートによって行われます。[more…]
- MutLの非特異的DNA切断はATP結合により抑制されていますが、そのエンドヌクレアーゼ活性の活性化機構は不明でした。本研究において筆者らはMutLのエンドヌクレアーゼ活性のATP結合依存的な抑制がATPの加水分解によって解除されることを見出しました。
本研究では、当室から提供した MutSタンパク質発現クローンTEx18D08 (cat.# THR007280)
及び MutLタンパク質発現クローンTEx18C04 (cat.# THR007252) がATPase assayに使用されました。
- 論文
Shimada A, Kawasoe Y, Hata Y, Takahashi TS, Masui R, Kuramitsu S, Fukui K. MutS stimulates the endonuclease activity of MutL in an ATP-hydrolysis-dependent manner. FEBS J. 280(14):3467-3479, 2013. PMID : 23679952.
- 使用されたリソース
TEx18D08 (Thermus thermophilus MutS)
TEx18C04 (Thermus thermophilus MutL)
オートファジー活性を定量的に評価できるプローブ(2019/2/1 N.N.)
- オートファゴソームを可視化してオートファジーを観察するためにMAP1LC3 (LC3)と蛍光タンパク質を融合させたプローブが利用されています。一方で、オートファジーの進行に伴いプローブの蛍光が減衰するため、定量的な活性評価には不向きでした。
- 東京大学の水島昇先生らは、LC3とGFPを融合したGFP-LC3と、末端のグリシン (G)を欠くLC3とRFPを融合したRFP-LC3ΔGを同時に当モル量で発現するプローブを開発しました。[more…]
Akaluc 新規開発の赤色発光のルシフェラーゼ (2018/5/7 N.N.)
- ホタルの生物発光システムは、生命現象のイメージングに汎用されていますが、発光基質の組織透過性が低いという欠点がありました。理研脳神経科学研究センターの宮脇 敦史先生、岩野 智先生、電気通信大学大学の牧 昌次郎先生らのグループは、生きた動物個体深部を非侵襲的に観察できる人工生物発光システムAkaBLIを開発しました。[more…]
- AkaBLIシステムは、組織透過性の向上した人工基質AkaLumineとAkaLumineに合わせて開発した人工酵素Akalucで構成されています。AkaBLIの発光シグナルの強度は、従来と比べ100～1000倍です。
- 宮脇研究室より、人工酵素Akalucの発現ベクターが当遺伝子材料開発室に寄託され、提供可能となりました。皆様の活発なご利用をお待ちしております。
- 論文
Iwano, S. et al., Single-cell bioluminescence imaging of deep tissue in freely moving animals. Science 359 (6378): 935-939 (2018). PMID 29472486.
- プレス
「脳の深部を非侵襲的に観察できる人工生物発光システムAkaBLI」 (2018/2/23 理研)
- DNA resource
pcDNA3 Venus-Akaluc (cat# RDB15781)
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