BRC RESOURCE NEWS
Contents:
- オルガネラコンタクトサイトを可視化するSplit-GFPプローブ (2022/12/16)
- 明るく、退色しにくい新規の緑色蛍光タンパク質 「StayGold」 (2022/08/05)
- 哺乳動物細胞用の遺伝子発現ベクター pEF-BOSシリーズ (2022/03/19)
オルガネラコンタクトサイトを可視化するSplit-GFPプローブ (2022/12/16)
- オルガネラが異なるオルガネラと結合する領域（オルガネラコンタクトサイト）の観察は、固定化した細胞を用いた解析が一般的です。生細胞における解析方法も報告されていますが、検出感度が低いなどの問題がありました。山形大学の田村康先生、京都産業大学の遠藤斗志也先生の研究グループは、Split-GFPの特性を利用して、オルガネラコンタクトサイトを可視化するための有効なツールを開発しました (Kakimoto, Y. et al., Sci. Rep. 8 (1): 6175, 2018. PMID 29670150)。
- Split-GFPは、二つに分割されたGFPのタンパク質断片であり、それぞれは蛍光を発しません。一方、これらの断片が近接することで、GFPが再構築され、その蛍光が復活します。研究グループは、GFPを構成する11本のβストランドをN末端側の10本(GFP1-10)とC末端側の1本(GFP11)に分割し、それぞれ異なるオルガネラに局在するタンパク質に結合し発現させました。観察された蛍光が、本来のオルガネラコンタクトサイトの形状に応じて検出されたこと、既知のオルガネラ結合因子と同じ場所に観察されたことなどから、生きた細胞内のオルガネラコンタクトサイトが可視化されたことが分かりました。
- ミトコンドリアや小胞体などへの局在配列にGFP1-10並びにGFP11が融合した、哺乳動物細胞発現用や出芽酵母に用いるゲノムインテグレーション用のSplit-GFPプローブプラスミドなどを田村先生から寄託していただきました。皆様の活発なご利用をお待ちしております。
- プラスミドリスト
- 参考論文など
- Kakimoto, Y. et al., Sci. Rep. 8 (1): 6175, 2018. PMID 29670150
- Tashiro, S. et al., Front. Cell Dev. Biol., 8: 571388, 2020. PMID 33330450
- Shirane, M. et al., Nat. Commun., 11 (1): 4576, 2020. PMID 32917905
- 実験医学 2022年 6月号 Vol.40 No.9 クローズアップ実験法
- オルガネラ（細胞小器官）間相互作用の可視化に成功～細胞内構造のこれまでの概念を一新～(山形大学、京都産業大学プレスリリース 2018.4.18)
- YU-SDGsプロジェクト 「オルガネラコンタクトサイトの謎を解明する」
(EXR0119j 2022.12.16 N.N)
明るく、退色しにくい新規の緑色蛍光タンパク質 「StayGold」 (2022/08/05)
- オワンクラゲから緑色蛍光タンパク質（GFP）が発見されて以降、様々な波長域を持つたくさんの蛍光タンパク質が発見・開発され、細胞内のタンパク質の局在や動態を解析するための可視化ツールとして活用されています。一方で、蛍光タンパク質は、高輝度での撮影のために強い励起光を照射したり、経時的な変化を観察するために繰り返し光を照射すると褪色し、シグナルが減弱するという欠点がありました。
- 理化学研究所脳神経科学研究センターの宮脇敦史チームリーダーと東北大学、北里大学、花王との共同研究グループは、野生型タマクラゲ由来の新規の緑色蛍光タンパク質CU17Sの遺伝子を単離し、培養細胞や大腸菌に導入したところ、暗いものの退色しにくい特性を有していることを見出しました。さらに、CU17S遺伝子に特定の変異を導入することで、極めて退色しにくい性質はそのままに非常に明るい蛍光タンパク質を開発することに成功しました。この蛍光タンパク質は、明るくいつまでも輝き続けるという意味を持つ「StayGold」と命名されました（Hirano, M. et al., Nat. Biotechnol. 2022. PMID: 35468954）
- StayGoldの光安定性は、既存の蛍光タンパク質と比較して、最大で１00倍程度優れています。宮脇敦史チームリーダーらは、StayGoldの退色しにくいという特性を活かし、連続的な照明の下、経時的な蛍光観察を行って、小胞体などの細胞内器官の動的構造変化を明らかにしました。また、SARS-CoV-2のスパイクタンパク質にVHH抗体とともに結合させ、感染細胞内でウイルス粒子が成熟する過程の観察に成功しました。
- この度、宮脇敦史チームリーダーより標的遺伝子をN末端、あるいはC末端に融合できるStayGold (cat# RDB19605: (n1)StayGold/pRSET、cat# RDB19606: (n1)StayGold(c4)/pRSET)や微小管滑走分子などを効率よく蛍光標識するためにStayGoldを直列に連結したtandem dimer StayGold (cat# RDB19609: tdStayGold/pcDNA3)など計10種類のプラスミドを寄託していただきました。皆様の活発なご利用をお待ちしております。
- プラスミドリストは、下記をご参照ください。
Hirano, M. et al. A highly photostable and bright green fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 2022 Apr 25. doi: 10.1038/s41587-022-01278-2. Epub ahead of print. PMID 35468954.- RDB19605 (n1)StayGold/pRSET
Fluorescent protein StayGold for fusion to the C-terminus of target molecule - RDB19606 (n1)StayGold(c4)/pRSET
Fluorescent protein StayGold for fusion to the N-terminus of target molecule - RDB19607 (n1)oxStayGold/pRSET
Fluorescent protein oxStayGold for fusion to the C-terminus of target molecule - RDB19608 (n1)oxStayGold(c4)/pRSET
Fluorescent protein oxStayGold for fusion to the N-terminus of target molecule - RDB19609 tdStayGold/pcDNA3
Fluorescent protein tdStayGold for fusion to the C-terminus of target molecule - RDB19610 tdStayGold(c4)/pBS Coupler
Fluorescent protein tdStayGold for fusion to the N-terminus of target molecule - RDB19611 tdoxStayGold/pcDNA3
Fluorescent protein tdoxStayGold for fusion to the C-terminus of target molecule - RDB19612 tdoxStayGold(c4)/pBS Coupler
Fluorescent protein tdoxStayGold for fusion to the N-terminus of target molecule - RDB19613 er-(n2)oxStayGold(c4)
Vector for ER labeling with fluorescent protein oxStayGold - RDB19614 mt-(n1)StayGold
Vector for Mitochondria labeling with fluorescent protein StayGold
- RDB19605 (n1)StayGold/pRSET
(EXR0118j 2022.08.05 N.N)
哺乳動物細胞用の遺伝子発現ベクター pEF-BOSシリーズ (2022/03/19)
- pEF-BOS、並びにpEF-BOS-EXベクターは、大阪大学 免疫学フロンティア研究センターの長田 重一 先生らによって開発された哺乳動物細胞用の遺伝子発現ベクターです (Mizushima, S and Nagata, S. Nucleic Acids Res. 18 (17): 5322, 1990、Murai, K. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95 (7): 3461-3466, 1998)。これらのベクターは、ヒト由来のポリペプチド鎖伸長因子EF-1αプロモーターが搭載されており、細胞種に依存しない高いプロモーター活性により、様々な細胞種への遺伝子導入実験に用いられています。
- この度、長田先生よりpEF-BOS-EXを改良した付加価値の向上したベクター、すなわち目的遺伝子産物にFLAGタグを融合できるpEF-Flag-EX (RDB18972)、並びに目的遺伝子の安定発現細胞株を作製するために用いるネオマイシン耐性マーカーを持つpNEF-BOS-EX (RDB18970)とピューロマイシン耐性マーカーを持つpPEF-BOS-EX (RDB18971)を寄託していただきました。皆様の活発なご利用をお待ちしております。
Cat.# Resource name Remarks RDB07939 pEF-BOS RDB07940 pEF-BOS-EX RDB18972 pEF-Flag-EX N-terminal FLAG-tag RDB18970 pNEF-BOS-EX Selectable markers in mammalian cells, Neomycin RDB18971 pPEF-BOS-EX Selectable markers in mammalian cells, Puromycin
(EXR0117j 2022.03.19 N.N)
(GRP0071j 2022.03.19 N.N)
2022.08.05
