rdb05956ja

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CMV tag vectors

これら6クローンは、竹本佳弘先生により開発され、DNA Cell Biol 1997 Jul;16(7):893-896に発表された哺乳動物細胞発現ベクターである。ヒトサイトメガロウイルス由来のプロモーター（CMV promoter）を搭載していて、NotIサイトに目的遺伝子のORFを挿入することにより、エピトープでtaggingされた目的遺伝子の発現プラスミドが得られる。エピトープにはHA、T7、Mycが選択可能であり、それぞれ1コピーおよび2コピーのタグが用意されている。これら6クローンのNotIサイトは共通の読み枠にあるので、NotIを利用したベクター乗り換えも可能である。（理研BRC・遺伝子材料開発室）
Sequence of MCS (pdf)

pRSV_S-FLAG

哺乳動物細胞発現ベクターpRSV_S-FLAGはpRc/RSVより改変したベクターであり、RDB 5956 pCMV_S-FLAGのバリアントである。レトロウイルス由来のプロモーター（RSV promoter）を搭載していて、NotIサイトに目的遺伝子のORFを挿入することにより、FLAGエピトープ (Met-DYKDDDDK)でtaggingされた目的遺伝子の発現プラスミドが得られる。制限酵素により切出した断片によるクローニングの他、NotI サイトをklenow enzyme で平滑化し、そこに第１コドンのATGから始まるPCR断片を組込むことも可能である。ただし、ATGGとなる配列で始まるPCR断片を組込むとGCGGCCATGGとなり、NcoIサイト(CCATGG)ができるので注意が必要である。このような場合は、第２コドンから始まるPCR断片を作製されることをお勧めする。タグの配列の翻訳開始点にはKozakのconsensus 配列 (CACCATG)がある。またここにあるNcoIサイト(CCATGG)のATGと同じ読み枠でタグの配列が続くので、NcoIサイトを利用して切出すことで、多くの大腸菌発現ベクターに同じ読み枠で載せ換えることも可能である。この配列のすぐ上流にはEcoRI サイトがあるので、タグのついた配列を切出し、アデノウイルスベクター (pAxCAwtit2など)に載せ換えることも可能である。pRSV_tagベクターシリーズは、ネオマイシン耐性遺伝子を搭載したベクターであり、薬剤による導入細胞の選択が可能である。（理研BRC・遺伝子材料開発室）

pCMV_s-FLAGc

哺乳動物細胞発現ベクターpCMV_s-FLAGcはpCMV_S-FLAG (RDB 5956)より改変したCMV promoterによる発現ベクターである。Gateway(R)テクノロジーにより、Gateway(R)エントリークローンにクローニングされている遺伝子断片を容易にこのpCMV_s-FLAGcに載せ替えることができる。ネオマイシン耐性遺伝子を搭載したベクターであり、薬剤による導入細胞の選択が可能である。（理研BRC・遺伝子材料開発室）

pCMV_S-FLAG

哺乳動物細胞発現ベクターpCMV_S-FLAGはpRc/CMVより改変したベクターである。ヒトサイトメガロウイルス由来のプロモーター（CMV promoter）を搭載していて、NotIサイトに目的遺伝子のORFを挿入することにより、FLAGエピトープ (Met-DYKDDDDK)でtaggingされた目的遺伝子の発現プラスミドが得られる。制限酵素により切出した断片によるクローニングの他、NotI サイトをklenow enzyme で平滑化し、そこに第１コドンのATGから始まるPCR断片を組込むことも可能である。ただし、ATGGとなる配列で始まるPCR断片を組込むとGCGGCCATGGとなり、NcoIサイト(CCATGG)ができるので注意が必要である。このような場合は、第２コドンから始まるPCR断片を作製されることをお勧めする。タグの配列の翻訳開始点にはKozakのconsensus 配列 (CACCATG)がある。またここにあるNcoIサイト(CCATGG)のATGと同じ読み枠でタグの配列が続くので、NcoIサイトを利用して切出すことで、多くの大腸菌発現ベクターに同じ読み枠で載せ換えることも可能である。この配列のすぐ上流にはEcoRI サイトがあるので、タグのついた配列を切出し、アデノウイルスベクター (pAxCAwtit2など)に載せ換えることも可能である。pCMV_tagベクターシリーズは、ネオマイシン耐性遺伝子を搭載したベクターであり、薬剤による導入細胞の選択が可能である。
pCM1_s-FLAG、pCM2_s-FLAGならびにpCM3_s-FLAGは、pCMV_S-FLAGのCMVプロモーター上にあるTGACTCAに塩基置換を施した変異プロモーターを持つ。
RDB 5956 pCMV_S-FLAG ATA GCG GTTTGA CTC ACG GGG
RDB 6324 pCM1_s-FLAG ATA GCG GTT TGC CTCGCG GGG
RDB 6325 pCM2_s-FLAG ATA GCG GTT AGA CTC CCG GGG
RDB 6326 pCM3_s-FLAG ATA GCG G–T TGC CTC GCG GGG
（理研BRC・遺伝子材料開発室）

ベクターの使用例

GFPならびにlacZ発現ベクターの構築

1. pCMV_S-FLAG (RDB 5956)をNotI 消化後klenow enzyme により平滑化し、アガロースゲル電気泳動を行い、約5.5 kbpのDNA断片を回収した。
2. pEGFP-C1 (Clontech)ならびにpcDNA4/HisMax/lacZ (Invitrogen)のGFPならびにlacZのORFをPCRにより増幅した。
3. このPCR産物を消化済みpCMV_S-FLAGにDNA Ligation kit ver.1 (Takara)を用いてライゲ－ションした。
4. 大腸菌コンピテントセルDH5 alpha に導入し、アンピシリンを含むLBプレートに播き、形質転換体を得た。
5. 得られたコロニーをLB Amp液体培地にて培養し、培養細胞導入用のプラスミドを調製した。

Primer配列
GFP primer
GFP_F 5′-ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG -3′
GFP_R 5′-TTATCTAGATCCGGTGGATCC -3′
lacZ primer
lacZ_F 5′-GATCCCGTCGTTTTACAACGT -3′
lacZ_R 5′-TTATTTTTGACACCAGACCAA -3′

GFP、beta-galactosidaseならびにFLAGタグの検出

本ベクターを用いた遺伝子導入、顕微鏡観察ならびにウエスタンブロッティングによるGFP、beta-galactosidaseならびにFLAGタグの検出は、ラボマニュアル発現ベクターの使用をご覧ください。

提供形態ならびに提供申込方法

• 個別のクローンをＤＮＡ溶液 (TE buffer)でお送りします。

生物遺伝資源提供依頼書類の入手と記入

次の書式に記入してください:

• 書式A
  

  書式A （遺伝子材料提供依頼書） [Word]

  1部

• 書式C
  • 提供制限欄には、クローン毎にウェブカタログをご参照いただき、記入をお願いいたします

  書式C (生物遺伝資源提供同意書, MTA) 非営利学術目的用 [Word] 書式C (生物遺伝資源提供同意書, MTA) 営利目的用 [Word]

  2部

• その他の書式

  提供承諾書(書式D)(クローンにより、必要な場合があります)

  1部

• 書類の送付とお問い合わせ
  

  書面をカラースキャンしたPDFファイルをemailにてお送りください。 紙面で公印またはサインが必要な場合は、後日、原本2部をご郵送ください。 なお、手続き完了した書類は、お送りいただいた方法でお届けいたします。 書類の送付先、問い合わせ先 〒305-0074　 茨城県つくば市高野台3-1-1 　 理化学研究所バイオリソース研究センター 　 遺伝子材料開発室 　 E-mail: dnabank.brc@riken.jp 　 TEL: 029-836-3612 (平日の9:00～12:00 / 13:00～17:00) 　 FAX: 029-836-9120 提供申込の前に、「申込書類の記入と送付」「ご利用にあたって」「遺伝子材料の品質管理」をご覧ください。 書式の詳細は「申込みに必要な書式」をご覧ください。

• 提供手数料：（1本あたり)
  

  非営利学術目的	8,440円
  営利目的	16,880円
  別途、リソースの送料及び箱代等が加算されます。 提供手数料は非営利学術目的利用と営利目的利用で異なります。「非営利学術目的利用」および「営利目的利用」の区分ならびに「提供手数料」は、「提供手数料一覧」をご参照ください。 請求書は遺伝子材料発送とは別に送付いたしますので、指定の銀行口座にお振込みください。 特別な様式の請求書・納品書・領収書を必要とされる場合は、申込の際にその様式の書類を必ず同封して申込みください。 振込み手数料につきましては、依頼者負担にてお願い致します。 2019年10月1日から提供手数料を改定しました [link]

 
(GRP0049, 2015.06.04)
2018.03.04