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BAC クローンの取り扱い


BAC クローンの取り扱い

  • 受け取ったBACクローンのバイアルを一時保存したい。
    BACクローンは、大腸菌組換え体を寒天培地に穿刺して培養しています。室温で輸送しています。受け取ったバイアルは、4℃で一時保存可能です。お受け取り後1週間以内を目安にグリセロールストックを作製し、保存してください。菌の死滅の恐れがありますので、凍結保存は不可です。
  • Viability of recombinant E.coli in stab culture.

    Stab cultures of a recombinant E.coli, DH10B carrying a BAC clone of mouse MSM/Ms strain (MSMg01-174K01), were stored at different temperatures. Total and only dead cells were stained thiazole orange (TO) and propidium iodide (PI) , respectively.
    The viability of the E.coli were counted by flow cytometer at indicated days. (Okubo et al., unpublished)
  • スタブバイアルからどのようにBACクローンを培養するのか。
    白金耳を用い、2x LB寒天培地に塗り広げて培養し、そのシングルコロニーから2x LB液体培地で培養をしてください。菌体は培地の中ほどにありますので、白金耳は培地の中ほどまで突き刺してください。
  • BACクローンを長期保存したい。
    当室では、シングルコロニーから2x LB液体培地で37℃ 16時間培養し、培養液と等量の滅菌済み40%グリセロール溶液を加えて混和し、-80℃で保存しています。
  • BACクローンで使用している2x LBの組成を知りたい。
    当室で使用している2x LBの組成は、1 L用では
    bacto tryptone 20 g
    yeast extract 10 g
    NaCl 10 g
    これらを混和後、NaOH溶液でpH 7.0に調整し、オートクレーブ滅菌しています。

BAC DNA Preparation

  • BACクローンからどのくらいのDNAが回収できるのか
    シングルコロニーから2 mLの2x LB液体培地で37℃ 16時間培養した場合、概ね200 ngのDNAが回収できています。
  1. Ideally spread BAC on a LB plate to isolate single clolonies. Pick a single colony of BAC into 5mL of 2x LB culture containing a selective antibiotic – incubate at 37 degrees centigrade with shaking for 18-20 hrs.
  2. Collect the culture into a microtube, pellet the cells by centrifuge at 5,000 rpm for 5 mins in a bench top centrifuge, decant the supernatant.
  3. Resuspend the pellet in 300 uL of Qiagen solution P1 (cat no:19051) containing RNAaseA by pipetting – make sure that the cells are completely resuspended and no cell clumps!
    • Buffer P1
      50 mM Tris-Cl, pH 8.0; 10 mM EDTA; 100 ug/mL RNaseA
  4. Add 300 uL of Qiagen solution P2 (cat:19052), mix by hand-inversion 4 or 5 times (DO NOT VORTEX), incubate a room temp for 5 mins.
    • Buffer P2
      200 mM NaOH; 1% SDS (w/v)
  5. Add 300 uL of Qiagen solution P3 (cat 19053), seal the tubes and mix by inversion – leave on ice for 10 mins.
    • Buffer P3
      3 M potassium acetate, pH 5.5
  6. Centrifuge the tubes in a centrifuge at 15 krpm for 15 mins at 4 degrees centigrade.
  7. Transfer the entire supernatant to a fresh tube and precipitate the DNA by adding 700 uL of isopropanol, mix and leave at room temperature for 5 mins.
  8. Centrifuge the tubes in a centrifuge at 15 krpm for 15 mins at 4 degrees centigrade, carefully decant off the supernatant – white pellet should be visible. Wash with 70% EtOH then aspirate off ethanol. You do not need to remove all of the ethanol at this step, but you should minimize it.
  9. Add 50 uL of sterile TE (10mM Tris, pH 8, 1mM EDTA).
  10. Digest 8 uL of the DNA with 10 units of an appropriate restriction enzyme in 10 uL reaction mixture.
  11. Analyze the DNA by a pulsed-field gel electrophoresis.

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  • Yamaguchi, S., Niwa, R., Kazuki, Y., Ohbayashi, T. Application of a bacterial artificial chromosome modification system for a human artificial chromosome vector. Yonago Acta medica 54:021-031 (2011).
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  • Abe, K., Noguchi, H., Tagawa, K., Yuzuriha, M., Toyoda, A., Kojima, T., Ezawa, K., Saitou, N., Hattori, M., Sakaki, Y., Moriwaki, K., Shiroishi, T. Contribution of Asian mouse subspecies Mus musculus molossinus to genomic constitution of strain C57BL/6J, as defined by BAC-end sequence-SNP analysis. Genome Res., 14, 2439-2447 (2004). PMID: 15574823

(T.M. 2009.06.13)

2018.05.22