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プラスミドの取扱い


technicalnotes01.pdf

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DNAバンクのちょっとした話し
Mail News 2005.07.30 より
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■ プラスミドが増えたり増えなかったりという経験はありませんか?3 ml の少量培養ならDNA がとれるのに、
それを大量培養するとプラスミドの収量がとても少ない。同じ問題は、あるプラスミドクローンのovernight culture を
培養し直した時に起こりました。全くDNA が無いわけではないのですが、大量培養にしては量が少ない。
しかし、overnight culture そのものではプラスミドDNA がある程度は取れている。
前培養をするとDNA の収量が減る。それはなぜか?もしかしたら、いったん菌が増えきったらプラスミドが脱落していくのではないだろうか?

■ そう考えて、log phase で増やし続ければ問題は起きないのではないだろうか、という前提のもとで実験しました。
■ 08:00、プレートのsingle colony を4 ml の培地に植え付けました。
■ 12:00、そこから100 ul ずつ5本の2 ml 培地に植えました(前培養)。
■ 13:30から1時間おきに、それぞれから100 ul 取り、2 ml の培地に植えました(本培養)。 前培養3.5時間で菌の増殖は最大に達しました。
植え付けた時刻とその時のOD は、
1 13:30 0.255
2 14:30 0.680
3 15:30 0.792
4 16:30 0.840
5 17:30 0.799
■ 23:30、それぞれからDNA を調製しました。ゲルイメージは下記にあります。
NWL050730
■ 前培養の増殖が最大に達した菌(4と5)を植え付けた場合は、増殖途中の菌を植え付けた場合(1から3)に比べ、
DNA の収量が少なくなりました。このとから、増殖しきった前培養を植え付けた場合は、DNA の収量が少なくなることが分かりました。
■ DNA 調製のための大腸菌培養時間に違いがありますが、一番遅く植え付けた場合でも6時間の培養時間があります。
12:00にはじめた前培養は、本培養と同じく100 ul を2 ml の培地に植えていますが、3.5時間で菌の増殖が最大に達していますので、
6時間の培養時間は、菌の増殖に十分な時間を経過していると思います。従って、菌の増殖の差がDNA の収量に反映されたわけではないと考えています。
■ プラスミドを大腸菌から調製する場合、菌は増殖させ過ぎずにDNA を調製することが大切であることが分かります。
もちろん全ての場合にあてはまるわけではありませんが、いつもうまく行くDNA 取りが急にうまく行かなくなった場合には、このお話を思い出して下さい。(TM)