キーワード検索

 Keywords  
※ しぼり込み検索をする場合は、スペース(半角空白文字)で区切って単語を入力して下さい。

リソース情報

クロンテック社との、 蛍光タンパク質DsRed2とmCherryの学術利用目的の保存と提供に関するLIMITED USE LICENSE締結

遺伝子発現用・タンパク質産生用クローン&ベクター
  Promoter collection
  Epitope tag fusion clones
  SEREX cDNA クローン
  HLA antigen cDNA clone
  Nakamura & White RFLP clone

遺伝子解析のためのリソース
  培養微生物
  哺乳動物培養細胞
  実験動物個体
  試験管内実験

クローンセット&関連リソース
  Genomic clone
  cDNA clone
  Expression clone
  Libraries
  Others

生物種別リソース
  ヒト、マウス、ラット等哺乳動物
  ツメガエル、ホヤ等その他動物
  酵母・糸状菌
  微生物
  植物

組換えウイルス
  組換えアデノウイルス
  組換えウイルス産生用シャトルベクター

ゲノムDNA
  微生物株由来ゲノムDNA
  マウス系統由来ゲノムDNA

クローン検索
  キーワード検索
  寄託者リスト
  Gene Set Collection

発現ベクターの使用


GFP発現ベクターpCMFlag_EGFP (RDB 6071)ならびにlacZ発現ベクターpCMFlag_lacZ (RDB 6072)をCos-1細胞に遺伝子導入し、顕微鏡観察によるX-galの活性染色とGFP蛍光の観察、ならびにウエスタンブロットによるGFP、b-galおよびFLAGの検出例を記載しています。

顕微鏡観察によるGFPならびにlacZの検出

    1. あらかじめ12-wellプレートに培養し90%コンフルエントとなったCos-1細胞に、遺伝子導入試薬Lipofectamine 2000 (Invitrogen) を使用してプラスミドを導入した。

遺伝子導入手順 (wellあたり)
A. Lipofectamine 2000 (Invitrogen), 4 ul plus OptiMEMI (Invitrogen) 500 ul
B. DNA 1.6 ug plus OptiMEMI 500 ul
上記A B を混和後、培養液と入れ換えた。
6 hr後、通常の培養液と入れ換えた。

    1. 遺伝子導入24時間後、PBS(-)で2回洗浄した。
    2. 0.25% グルタルアルデヒドを500 ul/well添加した。
    3. 4℃でover nightインキュベーションした。
    4. PBS(-)で5回洗浄した。
    5. X-gal染色溶液を500 ul/wellずつ添加した。

X-gal染色溶液
50mM フェリシアン化カリウム 300 ul
50mM フェロシカン化カリウム 300 ul
1M MgCl2 0.6 ul
20mg/ml X-gal 150 ul
PBS(-) 750 ul

  1. 37℃で4hr保温した。
  2. PBS(-)で2回洗浄した。
  3. 顕微鏡明視野ならびに蛍光下で観察した。

 

Detection under microscope
pCMFlag_EGFP (RDB 6071) pCMFlag_lacZ (RDB 6072)
fluorescent image
X-gal staining

 

ウエスタンブロットによるGFP、beta-galactosidaseならびにFLAGタグの検出

    1. あらかじめ12-wellプレートに培養し90%コンフルエントとなったCos-1細胞に、遺伝子導入試薬Lipofectamine 2000 (Invitrogen) を使用してプラスミドを導入した。

遺伝子導入手順 (wellあたり)
A. Lipofectamine 2000 (Invitrogen), 4 ul plus OptiMEMI (Invitrogen) 500 ul
B. DNA 1.6 ug plus OptiMEMI 500 ul
上記A B を混和後、培養液と入れ換えた。
6 hr後、通常の培養液と入れ換えた。

    1. 導入後24時間に100 ulのRIPAバッファーで細胞を回収し、同量の2x Laemmli sample bufferを加えた後に95℃5分加熱し、蛋白質を調製した。
RIPA buffer final 40 ml
10% NP-40 1% 4.0 ml
sodium deoxycholate 0.25% 0.1g
0.25 M EDTA, pH 8.0 1 mM 160 ul
1 M tris, pH 7.8 50 mM 2.0 ml
5 M NaCl 150 mM 1.2 ml

Add an appropriate volume of inhibitor.

    1. SDS-PAGE (12%アクリルアミド)により10 ulの調製蛋白質を泳動後、PVDF膜 (Roche)に転写した。
    2. 膜を5%スキムミルクでブロッキング後、4℃で一次抗体とover nightインキュベーションした。

一次抗体
GFP… anti GFP (FL), rabbit (1,000 倍希釈; Santacruz Bio technology, sc-8334)
beta-gal… anti beta-gal, rabbit (1,000 倍希釈; Cappel, 55976)
FLAG… anti-FLAG M2 Monoclonal Antibody (5,000 倍希釈; SIGMA, F-3165)

    1. PBS-Tで10分x3回洗浄した。
    2. 一次抗体反応の膜を室温で二次抗体と1時間インキュベーションした。

二次抗体
GFP & beta-gal… anti rabbit IgG-HRP (NEB)
FLAG…anti mouse IgG (H&L)-HRP (BioRad)

  1. PBS-Tで5分x3回洗浄した。
  2. ECL試薬 (Pharmacia)ならびにLas3000 (Fuji-Film)によりシグナルを検出した。

 

Detection by Western blotting
with anti-gfp with anti-FLAG with anti-galactosidase
lanes 1 and 2, pCMFlag_EGFP (RDB 6071); lanes 3 and 4, pCMFlag_lacZ (RDB6072)

 

ウエスタンブロットによるFLAGタグの検出

    1. あらかじめ24-wellプレートに培養し90%コンフルエントとなったCos-1細胞に、遺伝子導入試薬Lipofectamine 2000 (Invitrogen) を使用してプラスミドを導入した。

遺伝子導入手順 (wellあたり)
A. Lipofectamine 2000 (Invitrogen), 2 ul plus OptiMEMI (Invitrogen) 50 ul
B. DNA 0.8 ug plus OptiMEMI 50 ul
上記A B を混和後、培養液と入れ換えた。
さらにwellあたり100 ul OptiMEMI を加えた。
6 hr後、通常の培養液と入れ換えた。

    1. 導入後48時間に50 ulのRIPAバッファーで細胞を回収し、同量の2x Laemmli sample bufferを加えた後に95℃5分加熱し、蛋白質を調製した。
RIPA buffer final 40 ml
10% NP-40 1% 4.0 ml
sodium deoxycholate 0.25% 0.1g
0.25 M EDTA, pH 8.0 1 mM 160 ul
1 M tris, pH 7.8 50 mM 2.0 ml
5 M NaCl 150 mM 1.2 ml

Add an appropriate volume of inhibitor.

    1. SDS-PAGE により10 ulの調製蛋白質を泳動後、PVDF膜 (Roche)に転写した。
    2. 膜を5%スキムミルクでブロッキング後、4℃で一次抗体とover nightインキュベーションした。

一次抗体
FLAG… anti-FLAG M2 Monoclonal Antibody (5,000 倍希釈; SIGMA, F-3165)

    1. PBS-Tで10分x3回洗浄した。
    2. 一次抗体反応の膜を室温で二次抗体と1時間インキュベーションした。

二次抗体
FLAG…anti mouse IgG (H&L)-HRP (BioRad)

  1. PBS-Tで5分x3回洗浄した。
  2. ECL試薬 (Pharmacia)ならびにLas3000 (Fuji-Film)によりシグナルを検出した。