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BRCからのお知らせ

ゲノム編集 CRISPR/Cas9


ゲノム編集

当開発室では、 標的遺伝子を切断・改変できるゲノム編集技術ツール( CRISPR/Cas9 ツール)を収集・提供しています。当開発室で提供する研究ツールの多くは、国内外の研究者によって作製され、研究成果が論文として報告されている実績あるリソースです。
理研BRCは、米国ブロード研究所から、非営利学術目的の研究に限り、CRISPR/Cas9システムを用いたゲノム編集技術ツールの寄託の受け入れ、ならびに提供の許諾を受けております。ゲノム編集技術ツールの提供のご依頼のみならず、ご寄託でのご利用もお待ちしております。

・Cas9発現プラスミド

ssODN-mediated knock-in with CRISPR-Cas for large genomic regions in zygotes.

Yoshimi, K., Kunihiro, Y., Kaneko, T., Nagahora, H., Voigt, B., Mashimo, T.
Nat. Commun. 7: 10431 (2016). PubMed PMID 26786405.

Catalog number Name of clone Running title
RDB13130 T7-NLS hCas9-pA Cas9-poly(A) expressing improved plasmid.
  • 概要
    T7-NLS-hCAS9-pA は、poly A配列を付加することでCas9が安定して発現するin vitro転写用の発現プラスミドです。転写したCas9 mRNAと共に長鎖1本鎖DNAをマウスならびにラットの受精卵にインジェクション(Yoshimi, K. et al., 2016)、あるいはエレクトロポレーション(Miyasaka, Y. et al., 2018)することで、サイズの大きな外来遺伝子を高い効率でノックインすることに成功しています。
  • Depositor: Dr. Tomoji Mashimo
  • プレスリリース
    マウス・ラット等の遺伝子改変効率を向上させる新しい技術を開発
Catalog number Name of clone Running title
RDB14419 T7-NLS-hCAS9(D10A)-NLS-pA Cas9-poly(A) expressing improved plasmid.
RDB14420 T7-NLS-hCAS9(ver1.1)-NLS-pA Cas9-poly(A) expressing improved plasmid.
RDB14421 T7-NLS-hCAS9(D10A_ver1.1)-NLS-pA Cas9-poly(A) expressing improved plasmid.
RDB14657 T7-NLS-hCAS9-NLS-P2A-EGFP-pA Cas9-poly(A) expressing improved plasmid.
RDB14658 T7-NLS-hCAS9-NLS-P2A-mCherry-pA Cas9-poly(A) expressing improved plasmid.
  • 概要
    T7-NLS hCas9-pA (cat.# RDB13130)を改変したCas9-poly(A)発現プラスミドです。

A genome editing vector that enables easy selection and identification of knockout cells.

Nagasaki, A., Kato, Y., Meguro, K., Yamagishi, A., Nakamura, C., Uyeda, T.Q.P.
Plasmid 98: 37-44 (2018). PubMed PMID 30196057.

Catalog number Name of clone Running title
RDB16763 pGedit Plasmid vector for high efficiency genome editing oligo DNA containing target sequence.
  • 概要
    産業技術総合研究所の近江谷克裕先生、長崎晃先生等により開発された、Cas9およびgRNA 発現プラスミドです。
  • ゲノム編集するターゲット遺伝子が致死、あるいは検出が容易な表現型を示さないような場合、標的外の遺伝子変異を抑えることでスクリーニングと致死遺伝子同定に必要な労力を少しでも抑えることができます。ランダムにゲノムに挿入されるベクター数が多いとゲノムへの過剰なCas9酵素のアタックが起き、Off-targetの原因となると考えられています。
  • 長崎先生らが開発したpGedit (cat# RDB16763)はblasticidin S 耐性遺伝子 (Bsr) を持つCas9の発現ベクターです。より短時間で細胞を選択できるblasticidin S を使い、blasticidin Sの培地添加を24~48時間のみに限定することでベクターのゲノムへのインテグレーションを抑え、さらにEGFPをBsrと融合して発現することにより、ベクターの残存をモニターできるような工夫をしました。また、sgRNAスカフォールド内にあるRNA polymerase III terminal signal (TTTT)を取り除くことでsgRNA量を増加させ、ゲノム編集効率の増加を期待しています。
  • このプラスミドの有用性をみるため、ヒト骨肉腫上皮細胞U2OSを用いて2種類のヒト細胞質アクチン遺伝子、ACTBとACTG1に対するターゲット配列をpGeditに挿入し、この2つの遺伝子ノックアウト細胞株を取得する実験を行いました。その結果、それそれの遺伝子について約20の候補細胞から少なくとも5個のノックアウト細胞株を得ることに成功しました。

Rapid protein depletion in human cells by auxin-inducible degron tagging with short homology donors.

Natsume, T., Kiyomitsu, T., Saga, Y., Kanemaki, M.T.
Cell Rep. 15 (1): 210-218 (2016). PubMed PMID 27052166.

Catalog no. Name of clone Description
RDB13917 AAVS1 T2 CRIPR in pX330 A CRISPR/Cas plasmid for making DNA dounle-strand break at the human AAVS1 locus.

Depositor: Dr. Masato Kanemaki
Please visit the Auxin Inducible Degron (AID) System.


CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in the ascidian Ciona intestinalis.

Sasaki, H., Yoshida, K., Hozumi, A., Sasakura, Y.
Dev. Growth Differ.56 (7): 499-510 (2014). PubMed PMID 25212715.

Catalog number Name of clone Running title
RDB12994 pHTB Cas9 In vitro production of Cas9 mRNA.
RDB12999 pSPCiEF1>Cas9 Expression plasmid of Cas9.
  • 概要
    筑波大学の笹倉靖徳先生等により開発された、カタユウレイボヤ実験用Cas9-poly(A)発現プラスミドです。

 

ゲノム編集効率検証用プラスミド

Generation of CRISPR/Cas9-mediated bicistronic knock-in ins1-cre driver mice.

Hasegawa, Y., Hoshino, Y., Ibrahim, A.E., Kato, K., Daitoku, Y., Tanimoto, Y., Ikeda, Y., Oishi, H., Takahashi, S., Yoshiki, A., Yagami, K., Iseki, H., Mizuno, S., Sugiyama, F.
Exp. Anim. 65 (3): 319-327 (2016). PubMed PMID 27053096.

Catalog number Name of clone Running title
RDB13948 p2color Genome editing tool for confirming the activity of CRISPR/Cas9 system.

Depositor: Dr. Fumihiro Sugiyama


Generation of mutant mice by pronuclear injection of circular plasmid expressing Cas9 and single guided RNA.

Mashiko, D., Fujihara, Y., Satouh, Y., Miyata, H., Isotani, A., Ikawa, M.
Sci. Rep. 3: 3355 (2013). PubMed PMID 24284873.

Catalog number Name of clone Running title
RDB13532 pCAG-EGxxFP Plasmid clone for validation of sgRNA on double strand breaks by observation of green fluorescence.
  • 概要
    大阪大学の伊川正人先生等により開発され寄託された、蛍光強度を利用したゲノム編集効率を評価することができるベクターです (Mashiko, D. et al., 2013)。ゲノム編集を導入したい標的配列をPCRにより増幅した後、EGFP配列中に組込みます。このクローンとCas9発現クローン、ならびにガイドRNA発現プラスミドを同時に動物細胞に導入すると、標的配列の二本鎖DNAの切断に伴い、EGFP配列が修復されて緑色蛍光を生じます。

Catalog no. Name of clone Description
RDB16803 pCAG-NexxoR Selection plasmid for the positive clone of CRISPR/Cas9 system in the culture cells.
  • 概要
    国立精神・神経医療研究センター 照光実加先生、橋戸和夫先生らの研究グループにより開発された、ゲノム編集が設計通りに起きた細胞を薬剤耐性により効率的に濃縮できるプラスミドです。pCAG-EGxxFP (RDB13532)のEGFPをネオマイシン耐性遺伝子に置き換え改変したプラスミドです。
  • まずターゲット配列を含むゲノム断片を挿入したpCAG-NexxoR をモニタリング用プラスミドとして作製します。次に、ゲノム編集に必要な酵素およびガイドRNAをモニタリング用プラスミドと共に細胞に導入します。その後G418を加えた培地で耐性細胞を選択することにより、モニタリング用プラスミド上でゲノム編集が起きた細胞のみが生育し高効率でゲノム編集が起きた細胞を得ることができます。
    照光先生らによるC2C12培養細胞を用いたパイロット実験では、約98%の効率で変異体が得られ、変異体中の約2%がホモ変異体でした。(図1)
  • 実験結果の一例
    ゲノム編集用プラスミドpX330-ガイドRNA(pX330にガイドRNA配列を挿入)、pCAG-EGxxFP-target (pCAG-EGxxFPにtarget配列を挿入)をC2C12細胞にCotransfectionし、24時間後からG418添加培地で培養しました。このとき、pCAG-NexxoR-target(pCAG-NexxoRにtarget配列を挿入)、あるいはpCAG-NeoR (G418耐性遺伝子発現ベクター) もTransfectionしました。
    この結果から、薬剤耐性遺伝子の共発現だけでは選別できないことが示されNexxoRの有用性が示されました。(実験結果は、国立精神・神経医療研究センターの照光先生に提供していただきました。)

    図1.左: G418添加48時間でゲノム編集を生じた細胞(GFP陽性)が選別され、GFP陰性細胞はほぼ見られませんでした。
    中: G418添加無ではGFP陰性細胞が多く見られました。
    右: pCAG-NeoRのCotransfectionではゲノム編集を生じた細胞(GFP陽性)が選別されずGFP陰性細胞が多く見られました。

Quantitative assay for TALEN activity at endogenous genomic loci.

Hisano, Y., Ota, S., Arakawa, K., Muraki, M., Kono, N., Oshita, K., Sakuma, T., Tomita, M., Yamamoto, T., Okada, Y., Kawahara, A.
Biol. Open. 2 (4): 363-367 (2013). PubMed PMID 23616919.

Catalog number Name of clone Running title
RDB12261 pBR-lacZ alpha Plasmid clone for quantitative assay for genome editing at endogenous genomic loci.
  • 概要
    理化学研究所生命システム研究センター(QBiC)の久野悠先生等により開発され寄託された、青色・白色コロニーの出現比率によってゲノム編集効率を評価できるベクターです (Hisano, Y. et al., 2013)。ゲノム編集を試行後、標的配列をPCRにより増幅し、本クローンのlacZをコードする塩基配列中に挿入します。この際、増幅した配列がインフレームになるように設計して作製したクローンを用いて大腸菌を形質転換し、X-gal、IPTG、アンピシリンを添加した寒天培地に播種すると、増幅した標的配列が野生型アレルであれば青色コロニーが、編集が起こり読み枠にズレが生じた場合は、白色コロニーが出現します。
  • 論文
    Hisano,Y. et al., Quantitative assay for TALEN activity at endogenous genomic loci. Biology Open, 2, 363-367 (2013). [PMID: 23616919]

 

遺伝子挿入用ドナーベクター

An efficient system for homology-dependent targeted gene integration in medaka (Oryzias latipes).

Murakami, Y., Ansai, S., Yonemura, A., Kinoshita, M.
Zoological Lett. 3: 10 (2017). PubMed PMID 28694996.

Catalog number Name of clone Running title
RDB15409 pBaitD-gap43-linker-EGFP Donor plasmid for targeted insertion into the gap43 locus of Japanese medaka by the BaitD system.

Depositor: Dr. Masato Kinoshita


Precise in-frame integration of exogenous DNA mediated by CRISPR/Cas9 system in zebrafish.

Hisano, Y., Sakuma, T., Nakade, S., Ohga, R., Ota, S., Okamoto, H., Yamamoto, T., Kawahara, A.
Sci. Rep. 5: 8841 (2015). PubMed PMID 25740433.

Catalog number Name of clone Running title
RDB13480 pCS2P-tyr-mCherry-donor Donor vector for integrating mCherry into zebrafish tyrosinase locus.
RDB13481 pCS2P-krtt1c19e-linker-eGFP-mut-donor Donor vector for integrating eGFP mutant into zebrafish krtt1c19e locus
  • 概要
    理化学研究所生命システム研究センター(QBiC)の久野悠先生等により開発され寄託された、ゲノム編集技術を応用して外来遺伝子を導入するためのノックイン用マーカーです (Hisano, Y. et al., 2015)。 RDB13481はゼブラフィッシュの表皮細胞に発現するケラチンをGFPによって可視化することができます。
  • 論文
    Hisano, Y. et al., Precise in-frame integration of exogenous DNA mediated by CRISPR/Cas9 system in Zebrafish. Sci Rep. 5: 8841 (2015). [PMID: 25740433]

Rapid Protein Depletion in Human Cells by Auxin-Inducible Degron Tagging with Short Homology Donors.

Natsume, T., Kiyomitsu, T., Saga, Y., Kanemaki, M.T.
Cell Rep. 15 (1): 210-218 (2016). PubMed PMID 27052166.

Selection marker Attached tag at the N-terminus
mClover mCherry2 S tag-3FLAG
Hygro pMK376 pMK377 pMK375

 

Selection marker Attached tag at the C-terminus
mClover mCherry2 S tag-3FLAG
Neo pMK277 pMK280 pMK283
Hygro pMK278 pMK281 pMK284
BSD pMK388 pMK389 pMK390
Bsr pMK279 pMK282 pMK285
  • 概要
    国立遺伝学研究所の鐘巻将人先生等により開発さた、ゲノム編集技術を応用して蛍光タンパク質遺伝子や薬剤耐性遺伝子をゲノムに導入するためのノックイン用マーカーです。

 


・ゲノム編集リソースのご寄託をお願いいたします

ここ数年で劇的な進歩を遂げているゲノム編集技術は、基礎研究、応用研究問わず、生命科学を支える核となる技術の一つにまで発展してきました。それに伴って、ゲノム編集リソース開発者への分与依頼が増加することが予想されます。リソースを研究者間で共有することによって、実験の再現性が検証され、新しい研究成果へと繋がります。しかしながら、分与にかかる作業は個々の研究者の大きな負担となっております。当開発室に寄託していただくことで、分与にかかる負担を軽減し、研究活動に専心していただくことができます。是非ともリソースの寄託をご検討いただきますようお願い申し上げます。

「寄託・譲渡の申込み」をご覧ください。

(GRP0024j 2015.12.26 N.N.)

2019.10.01