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コスミドの取扱い


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テクニカルノート
Mail News 2010.10.18 より
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1.コスミドクローンの取扱いは熟練した技術が必要?
■ いえいえ、コスミドクローンで形質転換した大腸菌は、LB プレートでもLB 液体培地でも増やすことができます。
LB 液体培地で増やした形質転換大腸菌からのコスミドの調製は、プラスミドの調製と同じ試薬と同じ手順で – 若干の留意点を除けば- 可能です。
■ コスミドDNAを調製するには、プラスミドの場合と同様に、アルカリ法(※)によりDNAを溶出し、
エタノール沈澱と75% エタノールによる沈澱の洗浄の後、沈澱を滅菌水かTE バッファーに溶かします。
その後、除タンパクのためのフェノール抽出によるDNA の精製を行います。(※アルカリ法によるコスミドDNAの調製方法は、
http://dna.brc.riken.jp/lab/dna/rvd/SOP/Adv/adenovirus3.pdf
に記載していますので、ご覧ください。
■ 沈澱を乾燥し過ぎると、再び滅菌水に溶解するのは困難になります。そこで、遠心後の上清をピペットチップ等で丁寧に除き、
どうしても壁面に残る滴はろ紙かティッシュペーパー等のこよりで吸い取って、沈澱が湿っているうちに溶解して下さい。
もし、乾燥し過ぎてしまったら?溶かそうとして激しく撹拌や震盪をしますと、DNA が長いだけに物理的損傷が心配です。
解けにくくなった場合は、37℃に保温してゆっくり溶かして下さい。
■ コスミドで形質転換した大腸菌を長く継代していると、コスミドの欠失や大腸菌からの脱落が起きやすくなります。
そこでコスミドは形質転換した大腸菌をグリセロールストックで保存するよりは、DNA で保存し必要な時に大腸菌を形質転換することをお勧めします。
コスミドによる大腸菌の形質転換にはコスミドのパッケージングエキストラクトが必要になります。プラスミドもそうですが、コスミドの場合は特にクローンの
増殖のための培養時間が長くなり過ぎ無いように注意が必要です。培養開始時の植菌量が少ないと、どうしても液体培養の時間が長くなり、コスミドが脱落する傾向があります。
同様に、数百ml の培養をする際の前培養が長くなると、本培養で菌が十分増えていてもコスミドの収量がとても少なくなる傾向があります。
多少菌の増殖が悪くても、前培養も本培養も6-8時間程度にした方が無難です。
2.アデノウイルス作製用シャトルベクターの構造確認
■ 当バンクから組換えアデノウイルス作製用シャトルベクター(コスミド)の提供を受けた方からの問い合わせで比較的多いのは、
「クローンを確認するためにマップを見て制限酵素で切ったが期待されるインサートサイズのバンドがない。遺伝子が抜け落ちたのではないか?」
というものです。組換えアデノウイルス作製用シャトルベクターは40 kbp 前後有り、そこに各種遺伝子のcDNA が搭載されています。
そこで、100 ng 程度を制限酵素処理し、挿入されたcDNA 断片をアガロースゲル電気泳動で検出しようとしても、例えば1 kbp のインサートであれば
2.5 ng しか有りませんので、バンドがとても見えにくいのです。そのことを考慮して、インサートを確かめるには0.5~1 ug程度のDNA を使って下さい。(T.M.)